pitagora-network.github.io

• Orione論文: pubmed; Full text; Supplementary Data
• Orione 0.1 documentation

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Workflows ワークフロー

http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/suppl/2014/03/07/btu135.DC1/OrioneSuppMat.pdf

Galaxyのワークフローを用いて、異なるツールを組み合わせた再現性のある処理パイプラインを異なるデータセットに対して自動実行できる（パラメータをリセットする必要なし）。Orioneの主たる機能（前処理、細菌のde novo・再シーケンシング、RNA-Seq、メタゲノム解析）を網羅したワークフローを用意した。ワークフローの説明では、各ステップで使用するツールを[]括弧内に示した。リンク付きの補足資料

• Workflow #1: Pre-processing 前処理
• Workflow #2: Bacterial re-sequencing 細菌の再シーケンシング
• Workflow #3: Bacterial de novo assembly 細菌のde novoアセンブリ
• Workflow #4: Bacterial RNA-Seq 細菌のトランスクリプトーム解析
• Workflow #5: Metagenomics メタゲノム
• Workflow #6: Metatranscriptomics メタトランスクリプトーム

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準備: サンプルデータのインポート

• https://orione.crs4.it にアクセス
• 画面上部のShared Data -> Data Libraries をクリックして、Example: E. coli をクリック

NC_012967.1.fasta README.txt SRR030257_1.fastq SRR030257_2.fastq

“Import to current history”を選び、“Go”ボタンを押す。

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Workflow #1: Pre-processing 前処理

Input 入力:

• Raw FASTQ paired-end reads 未処理のペアエンド・リード配列（SRR030257_1.fastq と SRR030257_2.fastq）

Output 出力:

Steps 操作:

1. Conversion of the input FASTQ file to the fastqsanger quality encoding [FASTQ groomer] 入力FASTQファイルをfastqsangerクオリティ表記に変換

File to groom:  SRR030257_1.fastq

File to groom:  SRR030257_2.fastq

1. Quality control of raw reads [FastQC] 処理前のリード配列のクオリティ・コントロール

Short read data from your current history:  FASTQ Groomer on data *

Short read data from your current history:  FASTQ Groomer on data *

1. Adapter removal [Flexbar] アダプタ除去

Sequencing reads:  FASTQ Groomer on data * 2nd read set (paired):  ON Reads 2:  FASTQ Groomer on data *

1. Trimming/filtering by quality and length [FASTQ positional and quality trimming] クオリティと長さでトリミング/フィルタリング

Is this library mate-paired?:  Paired-end Forward FASTQ file:  Flexbar on data * and data * (FlexbarTargetFile-1.fastq) Reverse FASTQ file:  Flexbar on data * and data * (FlexbarTargetFile-2.fastq)

1. Filtering by sequence composition [Paired-end compositional filtering] 配列組成によるフィルタリング

Forward FASTQ file:  FASTQ positional and quality trimming on data * and data *: trimmed forward FASTQ Reverse FASTQ file:  FASTQ positional and quality trimming on data * and data *: trimmed reverse FASTQ

1. Quality control of processed reads [FastQC] 処理後のリード配列のクオリティ・コントロール

Short read data from your current history:  Paired-end compositional filtering on data * and data *: filtered forward FASTQ

Short read data from your current history:  Paired-end compositional filtering on data * and data *: filtered reverse FASTQ

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Workflow #2: Bacterial re-sequencing 細菌の再シーケンシング

Input 入力:

• Workflow #1で処理されたFASTQリード配列データ
• 参照ゲノム配列（NC_012967.1.fasta）

Output 出力:

• Contigs sequences (FASTA)
• Scaffolds sequences (FASTA)
• Scaffolds annotations (multiple formats available)
• Report with draft/contigs/scaffolds quality

Steps 操作:

1. Align against a reference genome with BWA [Map with BWA-MEM] BWAを用いて参照ゲノムにマッピング

Will you select a reference genome from your history or use a built-in index?:  Use one from the history Select a reference from history:  NC_012967.1.fasta Is this library mate-paired?:  Paired-end Forward FASTQ file:  trimmed forward FASTQ　（filtered forward FASTQ が表示されないバグ？） Reverse FASTQ file:  trimmed reverse FASTQ　（filtered reverse FASTQ が表示されないバグ？）

1. Convert alignment from SAM to BAM format [SAM to BAM] マッピング結果をSAM形式からBAM形式に変換

Choose the source for the reference list:  History SAM file to convert:  Map with BWA-MEM on data *, data *, and data *: mapped reads Using reference file:  NC_012967.1.fasta

1. Extract a draft consensus sequence [BAM to consensus] ドラフトのコンセンサス配列を抽出

Choose the source for the reference list:  History Input BAM file:  SAM-to-BAM on data * and data *: converted BAM Using reference file:  NC_012967.1.fasta

1. Convert the draft from FASTQ to FASTA [FASTQ to FASTA converter] ドラフトゲノムをFASTQ形式からFASTA形式に変換

FASTQ file to convert:  BAM to consensus on data * and data *: FASTQ

Output (FASTQ to FASTA on data *) contains 1 sequence by concatenating multiple sequences with ‘n’

1. Evaluate draft quality [Check bacterial draft] ドラフトゲノムのクオリティ評価

Draft genome:  FASTQ to FASTA on data * Reference genome:  NC_012967.1.fasta

1. Extract contigs (longer than a given threshold) from draft [Extract contigs] ドラフトゲノムからコンティグを抽出

Draft:  FASTQ to FASTA on data * Minimum contig length:  300

Output (Extract contigs on data *: contigs) contains 7 sequences.

Output (Extract contigs on data *: high quality contigs) contains 100 sequences.

1. Evaluate contigs quality [Check bacterial contigs] コンティグのクオリティ評価

Contigs collection:  Extract contigs on data *: contigs Estimated genome size in Mb:  4.629812

Contigs collection:  Extract contigs on data *: high quality contigs Estimated genome size in Mb:  4.629812

1. Contigs scaffolding by SSPACE/SSAKE [SSPACE/SSAKE] ペアエンドを使って、コンティグ配列を結合し、スーパーコンティグ（スキャフォールド）を生成する SSPACE (for paired-end reads) or SSAKE (for single-end reads)

Contigs FASTA file (-s):  Extract contigs on data *: high quality contigs Paired-end reads 1:  Paired-end compositional filtering on data * and data *: filtered forward FASTQ Paired-end reads 2:  Paired-end compositional filtering on data * and data *: filtered reverse FASTQ Insert size:  300 Variability (e.g. 0.25 for 25%):  0.25

1. Scaffolds evaluation [Check bacterial contigs] スキャフォールドの評価

Contigs collection:  SSPACE on data *, data *, and data *: final scaffolds Estimated genome size in Mb:  4.629812

10.Align scaffolds against reference [Mugsy] スキャフォールドを参照ゲノム配列にマッピング

Reference:  NC_012967.1.fasta Contigs/draft:  SSPACE on data *, data *, and data *: final scaffolds

1. Convert Mugsy output to FASTA [MAF to FASTA] Mugsyの出力をFASTA形式に変換

MAF file to convert:  Mugsy on data * and data *: MAF

12.Reformat FASTA output with 60 nucleotides per row [FASTA Width formatter] 配列の表示形式を行あたり60塩基になるように変換

Library to re-format:  MAF to FASTA on data * New width for nucleotides strings:  60

13.Annotate draft/contigs [Prokka] ドラフトゲノム（コンティグ）配列のアノテーション

Contigs to annotate:  FASTA Width on data * Fast mode (--fast):  Skip CDS /product searching

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Workflow #3: Bacterial de novo assembly 細菌のde novoアセンブリ

このワークフローは、複数のde novoアセンブラー（Velvet, ABySS, SPAdes）を用いて、細菌ゲノムのde novoアセンブリを実行する。このワークフローでは、異なるK-mer値でVelvetを3回実行し、コンティグをマージしCD-HITツール（類似度1.0）でクラスタリングする。コンティグをCISAで統合し、基本的な統計を“Check bacterial contigs”ツールで計算し、最後にProkkaで配列をアノテーションする。

Input 入力:

• Workflow #1で処理されたFASTQリード配列データ

Output 出力: • Contigs/Scaffolds from each assembler (FASTA) • Integrated contig sequences (FASTA) • Sequence annotations (multiple formats available) • Report with de novo assembly statistics

Steps 操作:

1. Prepare reads for Velvet [velveth] with three k-mer values ３つのk-mer値でvelvethを実行

Hash Length:  21 Input Files  Input Files 1   file format:    fastq   read type:    -shortPaired reads   Dataset:    Paired-end compositional filtering on data * and data *: filtered forward FASTQ  Input Files 2   file format:    fastq   read type:    -shortPaired2 reads   Dataset:    Paired-end compositional filtering on data * and data *: filtered reverse FASTQ

1. De novo assembly with Velvet [velvetg] Velvetでde novoアセンブリ

Velvet Dataset:  velveth on data * and data *

1. Merge Velvet contigs and cluster them at 1.00 identity [CD-HIT] Velvetのコンティグをマージし、類似度1.0でクラスタリング

Sequences to cluster:  velvetg on data *: Contigs Similarity threshold: 0.75 - 1.0:  1.0

1. De novo assembly with ABySS [ABySS] ABySSでde novoアセンブリ

Paired Reads Files  Paired Reads Files 1  Paired read sequences:   Paired-end compositional filtering on data * and data *: filtered forward FASTQ  Paired Reads Files 2  Paired read sequences:   Paired-end compositional filtering on data * and data *: filtered reverse FASTQ [-k] K-mer size:  21

Tool execution generated the following error message: ERROR RUNNING COMMAND: gunzip /SHARE/USERFS/els7/users/biobank/galaxy/central/job_wd/000/167/167659/dataset_285127_files/abyss-3.sam.gz gzip: /SHARE/USERFS/els7/users/biobank/galaxy/central/job_wd/000/167/167659/dataset_285127_files/abyss-3.sam.gz: No such file or directory

1. De novo assembly with SPAdes [SPAdes] SPAdesでde novoアセンブリ

 Forward reads:   Paired-end compositional filtering on data * and data *: filtered forward FASTQ  Reverse reads:   Paired-end compositional filtering on data * and data *: filtered reverse FASTQ

1. Integrates contigs with CISA [CISA Contigs Integrator] CISAでコンティグを統合

Contigs file 1 Contigs file:  SPAdes scaffolds (fasta) Contigs file 2 Contigs file:  CD-HIT on data 64: representatives.fasta Expected Genome Size (bp):  4629812

1. Evaluate contigs/scaffolds quality [Check bacterial contigs] コンティグ/スキャフォールドのクオリティ評価

Contigs collection:  CISA Contigs Integrator on data * and data * Estimated genome size in Mb:  4.629812

1. Annotate sequences [Prokka] 配列のアノテーション

Contigs to annotate:  CISA Contigs Integrator on data * and data * Fast mode (--fast):  Skip CDS /product searching

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Workflow #4: Bacterial RNA-Seq 細菌のRNA-Seq解析

• [Galaxy Workflow

  W4 - Bacterial RNA-Seq

  Paired-end](https://orione.crs4.it/workflow/display_by_username_and_slug?username=puva&slug=w4—bacterial-rna-seq–paired-end) 入力データ：ペアエンド・リード配列

• [Galaxy Workflow

  W4 - Bacterial RNA-Seq

  Single-end](https://orione.crs4.it/workflow/display_by_username_and_slug?username=puva&slug=w4—bacterial-rna-seq) 入力データ：シングルエンド・リード配列

Listeria_monocytogenes_EGD_e_uid61583/NC_003210.fna Listeria_monocytogenes_EGD_e_uid61583/NC_003210.ptt Listeria_monocytogenes_EGD_e_uid61583/NC_003210.rnt L monocytogenes_EGD/NC_003210.fastq

• Data Libraryにアクセスし、[RNA-Seq - Listeria monocytogenes] に✔️を付けて、“Import to current history”を選び、“Go”ボタンを押す。

• 画面上部の Shared Data -> Published Workflows をクリックし、“W4 - Bacterial RNA-Seq

  Single-end” をimport

• Workflows をクリックし、“imported: W4 - Bacterial RNA-Seq

  Single-end” をRun

Step 1: Input dataset Reads in FASTQ format Reads - Single-end  L monocytogenes_EGD/NC_003210.fastq Step 2: Get EDGE-pro files (version 1.0.1)  RefSeq Genomic Accession ID   NC_003210

“Run workflow”ボタンを押す。

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